KM71菌株是专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。SMD1168H可以表达HIS4基因，不可利用营养缺陷培养基筛选重组成功的阳性菌落；pPICZ A, B, C，pPICZα A, B, C等具有Zeocin抗性基因的毕赤酵母表达质粒可使用100ug/ml的Zeocin或盐酸博来霉素进行筛选。SMD1168H毕赤酵母的表型为Mut+, Pep4–。Pep4–表示蛋白水解酶A缺陷，这有助于目标蛋白的稳定表达。Mut+表示SMD1168H含有正常功能的AOX1基因。毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶：AOX1、AOX2。野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可诱导 AOX1基因表达，AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上，很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的，若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut+型；AOX2是AOX1的同源基因（97%的同源性），在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时，AOX2基因会发挥作用，产生一种表型为MutS的突变株。但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱很多，结果使细胞代谢甲醇的能力下降，在甲醇培养基中生长缓慢。针对不同的蛋白，很难预测选择Mut+还是MutS作为宿主进行蛋白表达更好，虽然Mut+型酵母转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活性的蛋白质；MutS型酵母虽然生长缓慢，转录得到的mRNA比Mut+少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活性的蛋白质。SMD1168H化转感受态细胞经线性化的pPICZ A质粒（3.3kb，ZeocinR in E.coli/ Pichia pastoris）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

基因型：

pep4

表型（Phenotype）

Mut+, Pep4–

使用方法：

1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴5min，加热后快速插入冰中。
2. 取2-10μg 线性化质粒DNA和10 μl预变性 Carrier DNA加入到未融化的100μl 酵母感受态细胞，置于37℃水浴5min，中途颠倒混匀2次，直至感受态细胞完全融化（融化后及时取出）。
3. 加入1.5 ml室温平衡后的缓冲液PB溶液颠倒混匀。30℃水浴 60 min，每隔20 min 颠倒混匀。 室温3,000 rpm 离心10min弃上清留菌体沉淀，加入1.5 ml 缓冲液PC溶液重悬菌体。3000 rpm离心10min 弃上清留菌体沉淀，加入200 μl缓冲液PC溶液重悬菌体。
4. 将200 μl菌液全部涂布到相应的抗性平板，30℃恒温培养3-5天，直至平板出现酵母克隆。