KM71菌株是专门用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。KM71是组氨酸缺陷型菌株，基因组中组氨酸脱氢酶（His4）基因位点产生突变，自身无法合成组氨酸；部分携带HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPIC3.5K/pPIC9K/pAO815等）可以表达HIS4基因，与KM71互补，通过组氨酸缺陷培养基来筛选整合成功的阳性转化子；其他无HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒（pPICZ A, B, C，pPICZα A, B, C等）也可通过Zeocin或盐酸博来霉素筛选阳性转化子。KM71毕赤酵母的表型为MutS, Arg+ 。KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）存在突变，但在AOX1基因位点引入野生型ARG4基因从而使KM71菌株具有Arg+。因在AOX1基因位点引入野生型ARG4基因从而破坏了AOX1基因，产生了MutS表型；毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶：AOX1、AOX2。野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可诱导 AOX1基因表达，AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上，很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的，若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut+型；AOX2是AOX1的同源基因（97%的同源性），在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时，AOX2基因会发挥作用，产生一种表型为MutS的突变株。但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱很多，结果使细胞代谢甲醇的能力下降，在甲醇培养基中生长缓慢。针对不同的蛋白，很难预测选择Mut+还是MutS作为宿主进行蛋白表达更好，虽然Mut+型酵母转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质；MutS型酵母虽然生长缓慢，转录得到的mRNA比Mut+少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活力的蛋白质。KM71化转感受态细胞经线性化的pPIC9K质粒（9.3kb，AmpR in E.coli）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

基因型：

His4,aox1::ARG4, arg4

表型（Phenotype）

MutS, Arg+,His–

使用方法：

1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴5min，加热后快速插入冰中。
2. 取2-10μg 线性化质粒DNA和10 μl预变性 Carrier DNA加入到未融化的100μl 酵母感受态细胞，置于37℃水浴5min，中途颠倒混匀2次，直至感受态细胞完全融化（融化后及时取出）。
3. 加入1.5 ml室温平衡后的缓冲液PB溶液颠倒混匀。30℃水浴 60 min，每隔20 min 颠倒混匀。 室温3,000 rpm 离心10min弃上清留菌体沉淀，加入1.5 ml 缓冲液PC溶液重悬菌体。3000 rpm离心10min 弃上清留菌体沉淀，加入200 μl缓冲液PC溶液重悬菌体。
4. 将200 μl菌液全部涂布到相应的缺陷型平板培养基，30℃恒温培养3-5天，直至平板出现酵母克隆。