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GS115酵母感受态细胞(化转)

产品组成

规格

保存温度

GS115 Competent Cell

10×100 μL/支

-80 ℃(6 个月)

Carrier DNA (10 μg/μL)

100 μL

-20 ℃(12 个月)

缓冲液B

20 mL

-20 ℃(24 个月)

缓冲液C

11 mL

-20 ℃(24 个月)

货号 规格 纯度
Y0003 10×100 μL

产品基本信息

GS115菌株是用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。GS115是组氨酸缺陷型菌株,基因组中组氨酸脱氢酶(His4)基因位点产生突变,自身无法合成组氨酸;部分携带HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒(pPIC3.5K/pPIC9K/pAO815等)可以表达HIS4基因,与GS115互补,通过组氨酸缺陷培养基来筛选整合成功的阳性转化子;其他无HIS筛选标记的毕赤酵母表达质粒(pPICZ A, B, C,pPICZα A, B, C等)也可通过Zeocin或盐酸博来霉素筛选阳性转化子。GS115毕赤酵母的表型为His–,Mut+,His–表示GS115是组氨酸缺陷型菌株,不能在组氨酸缺陷型培养基中生长;Mut+表示GS115含有有功能的AOX1基因(毕赤酵母是甲醇营养型酵母,可利用甲醇作为唯一碳源。甲醇代谢的第一步是:醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛,毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶:AOX1、AOX2,野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物,甲醇可诱导 AOX1基因表达,AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上,很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的,若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut+型;AOX2是AOX1的同源基因(97%的同源性),在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时,AOX2基因会发挥作用,产生一种表型为MutS的突变株,但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱很多,结果是细胞代谢甲醇的能力下降,在甲醇培养基中生长缓慢。针对具体的蛋白,很难预测选择Mut+还是MutS作为宿主进行蛋白表达更好,虽然Mut+型酵母转录得到的mRNA更多,但超量的mRNA并不一定可以产生有活力的蛋白质;MutS型酵母虽然生长缓慢,转录得到的mRNA比Mut+少,但有可能更有利于蛋白形成正确构象,产生有活力的蛋白质)。GS115化转感受态细胞经线性化的pPIC9K质粒(9.3kb,AmpR in E.coli)检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

 

存储条件

-80°

使用方法

使用方法

  1. Carrier DNA 的预处理:将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴5min,加热后快速插入冰中。
  2. 取2-10μg 线性化质粒DNA 和10 μL 预变性 Carrier DNA加入到未融化的100μL 酵母感受态细胞,置于 30 ℃水浴,每隔 15 S颠倒混匀,直至感受态细胞刚好完全融化(融化后及时取出)。
  3. 加入 1.5 mL室温平衡后的缓冲液B溶液颠倒混匀。30℃水浴 60 min,每隔 20 min 颠倒混匀。 室温3,000 rpm 离心 10min 弃上清留菌体沉淀,加入 1.5 mL 缓冲液C溶液重悬菌体。3000 rpm 离心10min 弃上清留菌体沉淀,加入 100 μL 缓冲液C溶液重悬菌体。
  4. 将100 μL 菌液全部涂布到相应的缺陷型平板培养基,30℃恒温培养 3-5 天,直至平板出现酵母克隆。 

注意事项

注意事项

1. 初次使用 Carrier DNA,请把装有 Carrier DNA 的管子在沸水中煮沸 5 min,然后立即放在冰上,用后放在-20 ℃储存备用。 下次使用前请于冰上解冻 Carrier DNA。反复冻融 3-5 次后需 重新变性 Carrier DNA。 

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

4. 毕赤酵母适宜的生长温度是 28℃至 30℃,温度超过32℃影响酵母生长。