X-33菌株是用于重组蛋白表达的毕赤酵母菌株。X-33是未经过基因改造的野生型菌株（WT），不可利用营养缺陷培养基筛选重组成功的阳性菌落，一般使用100ug/ml的Zeocin或盐酸博来霉素进行筛选。X-33毕赤酵母的表型为Mut+（毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶：AOX1、AOX2，野生型毕赤酵母中大多数的醇氧化酶是 AOX1基因产物，甲醇可诱导 AOX1基因表达，AOX1蛋白产物最高可占细胞中可溶蛋白的30%以上，很多毕赤酵母表达质粒正是利用AOX1表达框进行外源基因表达的，若毕赤酵母含有有功能的AOX1基因就称为Mut+型；AOX2是AOX1的同源基因（97%的同源性），在缺失AOX1基因或AOX1基因丧失功能时，AOX2基因会发挥作用，产生一种表型为Muts的突变株，但AOX2基因氧化甲醇的能力比AOX1弱很多，结果是细胞代谢甲醇的能力下降，在甲醇培养基中生长缓慢。针对具体的蛋白，很难预测选择Mut+还是Muts作为宿主进行蛋白表达更好，虽然Mut+型酵母转录得到的mRNA更多，但超量的mRNA并不一定可以产生有活性的蛋白质；Muts型酵母虽然生长缓慢，转录得到的mRNA比Mut+少，但有可能更有利于蛋白形成正确构象，产生有活性的蛋白质）。X-33化转感受态细胞经线性化的pPICZ A质粒（3.3kb，ZeocinR in E.coli/ Pichia pastoris）检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

基因型：

wild-type

表型（Phenotype）

Mut+

1. Carrier DNA 的预处理：将Carrier DNA 插入95℃金属浴5 min或插入浮漂中95℃水浴5min，加热后快速插入冰中。
2. 取2-10μg 线性化质粒DNA和10 μl预变性 Carrier DNA加入到未融化的100μl 酵母感受态细胞，置于37℃水浴5min，中途颠倒混匀2次，直至感受态细胞完全融化（融化后及时取出）。
3. 加入1.5 ml室温平衡后的缓冲液PB溶液颠倒混匀。30℃水浴 60 min，每隔20 min 颠倒混匀。 室温3,000 rpm 离心10min弃上清留菌体沉淀，加入1.5 ml 缓冲液PC溶液重悬菌体。3000 rpm离心10min 弃上清留菌体沉淀，加入200 μl缓冲液PC溶液重悬菌体。

将200 μl菌液全部涂布到相应的抗性平板培养基，30℃恒温培养3-5天，直至平板出现酵母克隆。