Mach1-T1电击感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。Mach1-T1菌株由野生型non-K-12 E. Coli W菌株改造而来,是目前生长速度较快的感受态细胞之一,在平板上9 h可见克隆,缺失核酸内切酶 (endA),提高了质粒DNA的产量和质量;重组酶缺陷型 (recA1398)减少插入片段的同源重组概率,保证了插入DNA的稳定性;lacZΔM15的存在使Mach1-T1可用于蓝、白斑筛选;tonA突变赋予Mach1-T1菌株对噬菌体T1和T5的抗性。Mach1-T1电击感受态细胞经pUC19质粒(2686bp,AmpR)检测转化效率>109 cfu/μg DNA。
基因型
- φ80(lacZ)ΔM15 ΔlacX74 hsdR(rK- mK+) ΔrecA1398 endA1 tonA
- 取适量睿必特复苏液置37度预热1-2小时(每管感受态准备10ml复苏液)。
- 杀菌处理后的0.1 cm电击杯和杯盖插入冰中,压实冰面,电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
- 取-80℃保存的电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
(A)对于连接产物,部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化,无需进行DNA纯化,但 DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过1/10感受态。
(B)对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA,ddH2O溶解后电击转化。
- 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中(避免产生气泡),轻轻晃动使液面保持水平状态,盖上杯盖,插入冰中。
- 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV,将电击杯从冰中拿出,用吸水纸擦拭表面,吸干表面水渍,放入电转槽中,电击完成后拿出电转杯放室温,打开杯盖,15秒内加入0.9ml预热的睿必特复苏液(此步骤可在电转仪旁操作,无需在超净台操作),用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次,混匀后转移到50 ml离心管,向离心管中补加培养基至10 ml。37℃,250 rpm复苏60分钟。
- 5000 rpm 离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。