MC1061F-电击感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。MC1061F-菌株来源于E.coli B/r型SB3118菌株,同时也是DH10b及TOP10的母本菌株。MC1061F-化转感受态细胞转化效率极高,可用作实验室的常规质粒构建及噬菌体展示实验,但缺乏F`因子,不能用于丝状噬菌体(比如M13)的感染。不含核酸酶endA1突变,体内核酸酶含量较高,提取质粒时务必使用质粒提取试剂盒中去蛋白液尽量去除核酸酶对质粒的污染。此菌株具有链霉素抗性。MC1061F-电击感受态细胞经pUC19质粒(2686bp,AmpR)检测转化效率>1010 cfu/μg DNA。
基因型
araD139 Δ (araA-leu)7697 Δ(lac)X74 galK16 galE15(GalS) lambda- e14- mcrA0 relA1 rpsL150 (StrR) spoT1 mcrB1 hsdR2
- 取适量睿必特复苏液置37度预热1-2小时(每管感受态准备10ml复苏液)。
- 杀菌处理后的0.1 cm电击杯和杯盖插入冰中,压实冰面,电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
- 取-80℃保存的电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
(A)对于连接产物,部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化,无需进行DNA纯化,但 DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过1/10感受态。
(B)对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA,ddH2O溶解后电击转化。
- 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中(避免产生气泡),轻轻晃动使液面保持水平状态,盖上杯盖,插入冰中。
- 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV,将电击杯从冰中拿出,用吸水纸擦拭表面,吸干表面水渍,放入电转槽中,电击完成后拿出电转杯放室温,打开杯盖,15秒内加入0.9ml预热的睿必特复苏液(此步骤可在电转仪旁操作,无需在超净台操作),用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次,混匀后转移到50 ml离心管,向离心管中补加培养基至10 ml。37℃,250 rpm复苏60分钟。
- 5000 rpm 离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。