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DH10Bac 电转化感受态细胞

货号 规格
EL028-H-S 5×50 μL 价格:1000元

产品基本信息

DH10Bac电击感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。DH10Bac菌株主要用于生产重组杆状病毒分子(Bac-to-Bac杆状病毒表达系统)。该菌株中含有父本杆粒 bMON14272 、辅助质粒 pMON7124 :父本杆粒 bMON14272包含 mini-F复制子卡那抗性基因, attTn7 位点和 lacZα互补因子;辅助质粒 pMON7124 含有 tnsABCD区(tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid),编码转移酶和四环素抗性基因,这个辅助质粒促进Tn7转移。可提高供体质粒pFastBac(具有庆大霉素抗性)转化后的基因转座效率。mcrAmcrBCmrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNATherefore , genomic DNA , both  prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac)。recA1endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选。DH10Bac电击感受态细胞经pUC19质粒(2686bpAmpR)检测转化效率>2.5×109cfu/μg DNA

基因型

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)ϕ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124

存储条件

-80°

使用方法

  1. 取适量睿必特复苏液置37度预热1-2小时(每管感受态准备10ml复苏液)。
  2. 杀菌处理后的0.1 cm电击杯和杯盖插入冰中,压实冰面,电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
  3. 取-80℃保存的电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。

(A)对于连接产物,部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化,无需进行DNA纯化,但 DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过1/10感受态。

(B)对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA,ddH2O溶解后电击转化。 

  1. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中(避免产生气泡),轻轻晃动使液面保持水平状态,盖上杯盖,插入冰中。
  2. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV,将电击杯从冰中拿出,用吸水纸擦拭表面,吸干表面水渍,放入电转槽中,电击完成后拿出电转杯放室温,打开杯盖,15秒内加入0.9ml预热的睿必特复苏液(此步骤可在电转仪旁操作,无需在超净台操作),用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次,混匀后转移到50 ml离心管,向离心管中补加培养基至10 ml。37℃,250 rpm复苏60分钟。
  3. 5000 rpm 离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。

注意事项

  1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
  2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。 
  3. 当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。 
  4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
  5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。
  6. 对于连接产物,最好用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA后用适量ddH2O或TE缓冲液重悬产物,保证DNA浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。
  7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
  8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。