TOP10F`来源于TOP10菌株。将F´{lacIq Tn10 (TetR)}因子转入TOP10菌株,即为TOP10F`。该F`因子携带lacIq 抑制子,可抑制trc,tac,lac等启动子下游基因的表达,从而可以用于一些表达毒性蛋白质粒的扩繁。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。可用于构建克隆,蓝白斑筛选实验(如用于蓝白斑筛选,需在培养基中加入IPTG诱导β-半乳糖苷酶基因的表达),具有四环素抗性。TOP10F`电击感受态细胞经pUC19质粒(2686bp,AmpR)检测转化效率>109cfu/μg DNA。
基因型
F´{lacIq Tn10 (TetR)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG
1.取适量睿必特复苏液置37度预热1-2小时(每管感受态准备10ml复苏液)。
2.杀菌处理后的0.1 cm电击杯和杯盖插入冰中,压实冰面,电击杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
3.取-80℃保存的电击感受态细胞插入冰中5 分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
(A)对于连接产物,部分公司的T4连接酶体系或重组体系可与电击感受态混合后电击转化,无需进行DNA纯化,但 DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过1/10感受态。
(B)对离子浓度较高的DNA溶液或反应体系请用膜纯化或乙醇沉淀法纯化DNA,ddH2O溶解后电击转化。
4.用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中(避免产生气泡),轻轻晃动使液面保持水平状态,盖上杯盖,插入冰中。
5.启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV,将电击杯从冰中拿出,用吸水纸擦拭表面,吸干表面水渍,放入电转槽中,电击完成后拿出电转杯放室温,打开杯盖,15秒内加入0.9ml预热的睿必特复苏液(此步骤可在电转仪旁操作,无需在超净台操作),用1ml 枪吹吸电击杯底部2-3次,混匀后转移到50 ml离心管,向离心管中补加培养基至10 ml。37℃,250 rpm复苏60分钟。
6.5000 rpm 离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。